aisa

A.I.S.A. ha deciso di cofinanziare – insieme alle associazioni FASI, Atassia UK, AchAF, FARA e APAHE oltre, naturalmente a BabelFAmily stessa – questo progetto di ricerca.

Si tratta di un programma di ampio respiro, della durata prevista di almeno tre anni (2010-2012) e del costo complessivo di circa 125.000 Euro.

A brief summary of our contribution in the past

1) - FRDA understanding

Friedreich ataxia results from a lack of function of the frataxin protein due to a GAA expansion in the gene in a vast majority of the case [1]. Shortly after the identification of the gene involved in this disease, we reported the iron-sulfur protein and mitochondrial defect in affected tissues from the patients [2]. We ext described the vicious circle that seems to underlie the disease, intimately associating the loss of iron-sulfur clusters, an oxidative stress and a mitochondrial iron accumulation, which all have been suggested to play a role at some stage of the disease [3]. Finally we have shown the impaired response of frataxin-depleted cells and mice to oxidative insult [4].

2) - FRDA treatment

We therefore predicted as early as 1999 that the use of a mitochondrially-targeted antioxidant should lessen the consequences of frataxin depletion. We thus rapidly initiated the first clinical trial using idebenone, with some success at least on the heart hypertrophy frequently noticed in patients [5]. Then, we suggested to use an alternative approach directly targeting the loss of frataxin function, the initial step of the disease. With this aim, we suggested attempting to increase the overall transcription of mitochondrial proteins and mitochondrial antioxidant components, including frataxin itself, by testing a PPARy ligand. Thus we selected Pioglitazone a drug previously recommended to fight diabetes, but which was also shown to have protective effect in other neurological diseases. Following this suggestion, a double-blind placebo-controlled trial started in October 2008 in our hospital (2 years; 40 patients).

Our project: Identifying additional sensitive targets in Friedreich ataxia

By trialling the use of Pioglitazone and Idebenone, we targeted the initial and terminal steps of Friedreich ataxia. We now have the idea to target additional, intermediate and critical step(s) in the cellular consequences of frataxin depletion.

So far, it is quite difficult to order the different aspects of the cellular consequences of frataxin depletion, i.e. the loss of iron-sulfur clusters, the oxidative stress and the mitochondrial iron accumulation. Dealing with this latter, there is however a number of evidences, both in human and mouse defective in frataxin, suggesting that iron accumulation is rather a late phenomenon. Additionally, we recently provided evidence that chelating mitochondrial iron is a dangerous double-edged sword. Indeed severe mitochondrial iron depletion will result in the blockade of iron-requiring biosynthesis pathways (iron-sulfur and heme synthesis), ultimately resulting in cell death [6]. As a consequence, any long-term use of chelators targeting mitochondrial iron might thus reveal quite dangerous in human.

Interestingly enough, the loss of iron-sulfur cluster has been shown to be oxygen-dependent in frataxin-depleted yeast mutants, and human fibroblasts with low frataxin displayed increased-sensitivity to oxidative insult, yet with normal activity of the iron-sulfur cluster containing enzymes. This suggested that hyper sensitivity to oxidative stress is a very early event, possibly preceding iron-sulfur cluster quantitative loss. We and other ascribed this hyper sensitivity to impaired superoxide dismutase induction upon oxidative insult [4; 7]. More recently we established that this originated from a more general impairment of phase II antioxidant enzymes by the transcription factor Nrf2 [8].

While several groups devote a lot of effort to decipher the function of frataxin in the biosynthesis of iron-sulphur clusters, we rather decided in this new project to focus our attention on the mechanism which might explain the loss of Nrf2 function associated with the frataxin depletion. This unknown mechanism might shade new light on the frataxin function, help to identify new targets and open the way to a novel way to counteract the disease.

This is a several years project which will involve a number of steps:

1. Deciphering the nature and composition of the protein complex binding the actin-anchored Nrf2 to the mitochondria. Attempt to perform this analysis will be done by studying various human cell lines (including cells derived from neural tissues such as SK-N-AS) and primary human cells (skin fibroblasts). To note, we already know some of the components of this complex which will help for the identification of its other members.
   1. Study will include BN page analysis of the predicted complex under non-denaturating conditions, using the available series of antibodies targeting putative members of the complex. The complex will be obtained by standard pull-down methods starting by cellular disruption using mild conditions.
   2. If required, mass spectrometry-based analysis of the putative complex either using tandem affinity purification of tagged proteins of interest (possibly increasing the signal-to-noise ratio via the generation of clean samples), or by stable isotopic labelling of proteins to possibly discriminate between contaminants and bona fide binding partners using quantitative MS techniques. The recent recruitment in our group of a specialist of these techniques will make them readily available for the project if needed, the machine being by the way available in our hospital.
   3. Exclusion of the participation of a sub-pool of Frataxin might be at the end of this part, since such a putative sub-pool has been suggested to exist in cell cytosol.
   4. Parallel study with a similar series of analyses will, in a second step, be performed on patient cell lines. We already established that the phenotype of these cells already indicates a loss of Nrf2 anchoring to the actin network [8].
2. Targeting the various members of the complex. In this part of the project we will assess/check the relative role of the various components of the complex, in particular their role in the sensitivity to oxidative stress.
   1. we will make use of shRNA to extinct the various targets (the components of the complex) in a cell line (Flp-In T-Rex HEK-293) which allows a unique and directed insertion at a defined locus which expression can be in addition modulated by doxycycline. We previously used this approach successfully to over express an allotopic protein in the respiratory chain [9]. Extinction of the targeted gene expression will be checked by quantitative PCR and/or Western blotting.
   2. the obtained cells will be extensively characterized for their phenotype, especially for potential hampering of their sensitivity to oxidative stress. This will give us the opportunity to modulate cell culture conditions to determine if we can not modulate the consequences, possibly including iron-sulfur clusters stability, in these various cells.
3. the missing link... In this part of the project, we will attempt to characterize the link existing between the mitochondrial-matrix located frataxin and the cytosolic-located Nrf2-containing complex. Several hypotheses can be drawn to explain the disorganisation of the complex associated with frataxin-depletion.
   1. The first hypothesis is the over-production of oxidant species from frataxin-depleted mitochondria in patient fibroblasts. We will test this hypothesis by using redox-sensitive fluorescent probes, knowing that the flux of electrons in the respiratory chain of these frataxin-depleted cultured cells is not quantitatively affected. A whole set of respiratory chain deficient cells already known as producing such oxidant species will be used as positive controls[10].
   2. The second hypothesis would require the existence of an iron-sulfur protein in the Nrf2-binding complex which would be exquisitely sensitive (as compared to other ISP) to a decrease of the mitochondrial frataxin content. Indication about the occurrence of such protein could arise from the first part of this study. A protein as GRX2 which binds iron-sulfur cluster to dimerize would have been a perfect candidate, but we previously established that it is not affected in frataxin-depleted fibroblasts [8].
4. Restoring the normal response to oxidative insult. We previously established that trapping hydrogen peroxides (one of the oxidant compound released by mitochondria), restore Nrf2 normal function in patient fibroblasts. However, trapping hydrogen peroxide can have a whole series of consequences not necessarily restricted to or mediated by an effect on the Nrf2-binding complex, we would like to:
   1. Analyse/demonstrate the consequence of trapping the peroxide on the stability of the complex.
   2. Identify new compounds able to relocated Nrf2 in frataxin-depleted cells. For these part of the study we will used patient derived fibroblasts (immortalized fast growing cell line), using oxidant-induced cell death (tracing restored Nrf2 localization) as a criterion, and use the bank of compounds (80.000) we previously tested in previous research programs we were involved in.

Final deliverables might (should!) include:

• a better understanding of the hampered response of frataxin-depleted cell to oxidative stress;
• characterization of a protein complex (and associated signaling pathway) which might well play a considerable role in Friedreich ataxia and other neurodegenerative conditions as well;
• identification of new target(s) and new compound(s) to be trialled to counteract Friedreich ataxia

References

1. Campuzano V, Montermini L, Molto MD, Pianese L, Cossee M, Cavalcanti F, Monros E, Rodius F, Duclos F, Monticelli A, Zara F, Canizares J, Koutnikova H, Bidichandani SI, Gellera C, Brice A, Trouillas P, De Michele G, Filla A, De Frutos R, Palau F, Patel PI, Di Donato S, Mandel JL, Cocozza S, Koenig M, Pandolfo M. Friedreich's ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science 1996; 271; 1423-1427
2. Rotig A, de Lonlay P, Chretien D, Foury F, Koenig M, Sidi D, Munnich A, Rustin P. Aconitase and mitochondrial iron-sulphur protein deficiency in Friedreich ataxia. Nat Genet 1997; 17; 215-217
3. von Kleist-Retzow JC, Chantrel-Groussard K, Rotig A, Munnich A, Rustin P. [Friedreich ataxia. 3 years after the identification of the gene a glimmer of hope for therapy]. Dtsch Med Wochenschr 2000; 125; 293-295
4. 4. Chantrel-Groussard K, Geromel V, Puccio H, Koenig M, Munnich A, Rotig A, Rustin P. Disabled early recruitment of antioxidant defenses in Friedreich's ataxia. Hum Mol Genet 2001; 10; 2061-2067
5. Rustin P, von Kleist-Retzow JC, Chantrel-Groussard K, Sidi D, Munnich A, Rotig A. Effect of idebenone on cardiomyopathy in Friedreich's ataxia: a preliminary study. Lancet 1999; 354; 477-479
6. Goncalves S, Paupe V, Dassa EP, Rustin P. Deferiprone targets aconitase: implication for Friedreich's ataxia treatment. BMC Neurol 2008; 8; 20
7. Jiralerspong S, Ge B, Hudson TJ, Pandolfo M. Manganese superoxide dismutase induction by iron is impaired in Friedreich ataxia cells. FEBS Lett 2001; 509; 101-105
8. Paupe V, Dassa EP, Goncalves S, Auchere F, Lonn M, Holmgren A, Rustin P. Impaired nuclear Nrf2 translocation undermines the oxidative stress response in Friedreich ataxia. PLoS ONE 2009; 4; e4253
9. Dassa EP, Dufour E, Goncalves S, Paupe V, Hakkaart G, Jacobs HT, Rustin P. Expressing the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Mol Med 2009; 1; 30-36
10. Dassa EP, Paupe V, Goncalves S, Rustin P. The mtDNA NARP mutation activates the actin-Nrf2 signaling of antioxidant defenses. Biochem Biophys Res Commun 2008; 368; 620-624

Un breve sommario del nostro passato contributo

(traduzione dall'inglese di Carlo M.G. Penzo, supervisionata dal dott. Filippo Fortuna.)

1) - Comprendere la FRDA

L'atassia di Friedreich deriva, nella quasi totalità dei casi [1], da una mancanza nella funzione della proteina fratassina dovuta ad una espansione GAA nel gene. Poco dopo l'identificazione del gene coinvolto in questa malattia, scoprimmo la questa proteina ferro-zolfo e i difetti mitocondriali nei tessuti ammalati dei pazienti[2]. Abbiamo descritto estesamente il circolo vizioso che sembra sottostare alla malattia, associando intimamente alla perdita di complessi ferro-zolfo, uno stress ossidativo e un accumulo mitocondriale di ferro, che si sono tutti rivelati giocare un ruolo in un qualche stadio della malattia [3]. Infine abbiamo dimostrato l'insufficiente risposta di topi e cellule carenti di fratassina all'insulto ossidativo [4].

2) - Trattamento della FRDA

Abbiamo quindi predetto sin dall'inizio del 1999 che antiossidanti diretti ai mitocondri avrebbero diminuito le conseguenze della carenza di fratassina. Abbiamo allora rapidamente iniziato la prima sperimentazione clinica utilizzando Idebenone, con qualche successo almeno nell'ipertrofia cardiaca notata frequentemente negli ammalati [5]. Poi, abbiamo proposto di utilizzare un approccio alternativo puntando direttamente alla funzione di perdita della fratassina, il primo attore della malattia. Con questo obiettivo abbiamo proposto di cercare di accrescere l'intera trascrizione delle proteine mitocondriali e dei componenti antiossidanti mitocondriali, sperimentando un ligando dei recettori PPARγ. Abbiamo quindi selezionato il Pioglitazone, un medicinale in precedenza raccomandato per combattere il diabete, ma che aveva anche mostrato di avere un effetto protettivo in altre malattie neurologiche. Seguendo questa proposta è iniziata, nell'ottobre 2008, nel nostro ospedale (2 anni; 40 pazienti) una sperimentazione placebo-controllata in doppio-cieco.

Il nostro progetto: Identificare obiettivi sensibili addizionali nell'atassia di Friedreich

Sperimentando l'uso del Pioglitazone e dell'Idebenone abbiamo puntato al passo iniziale e finale dell'atassia di Friedreich. Ora abbiamo idea di puntare al passo(i) addizionale, intermedio e critico nelle conseguenze cellulari della carenza di fratassina.

Finora è abbastanza difficile ordinare i differenti aspetti delle conseguenze cellulari della carenza di fratassina, cioè la perdita di complessi ferro-zolfo, lo stress ossidativo e l'accumulo di ferro mitocondriale. In rapporto con quest'ultimo c'è tuttavia un numero di evidenze, in entrambi, uomini e topi carenti di fratassina, che suggeriscono che l'accumulo di ferro sia un fenomeno piuttosto tardivo. In aggiunta abbiamo di recente fornito evidenza che chelare il ferro mitocondriale è una pericolosa arma a doppio taglio. Infatti una forte carenza di ferro mitocondriale finisce per bloccare le vie biosintetiche che richiedono il ferro (sintesi dei complessi ferro-zolfo e dell'eme), provocando, da ultimo, la morte cellulare[6]. Come conseguenza, un uso prolungato di chelanti che agiscono depauperando il ferro mitocondriale può quindi rivelarsi abbastanza pericoloso per l'uomo.

Piuttosto interessante, la perdita dei complessi ferro-zolfo nei lieviti mutanti carenti di fratassina si è dimostrata ossigeno-dipendente, e i fibroblasti umani con bassa fratassina mostrano accresciuta sensibilità all'insulto ossidativo, anche con normale attività degli enzimi con complessi ferro-zolfo. Ciò suggerisce che l'ipersensibilità allo stress ossidativo sia un evento molto precoce, probabilmente antecedente alla perdita quantitativa dei gruppi ferro-zolfo. Noi ed altri attribuiamo questa ipersensibilità alla carente induzione della superossido dismutasi operata dallo stress ossidativo [4; 7]. Più recentemente abbiamo stabilito che questo si origina da una più generale insufficienza degli enzimi antiossidanti di fase II regolati dal fattore di trascrizione Nrf2 [8].

Mentre diversi gruppi dedicano una quantità di sforzi nel decifrare la funzione della fratassina nella biosintesi dei gruppi ferro-zolfo, noi abbiamo invece deciso, in questo nuovo progetto, di focalizzare la nostra attenzione sul meccanismo che può spiegare la perdita di funzione di Nrf2 associata alla carenza di fratassina. Questo sconosciuto meccanismo può gettare nuova luce sulla funzione della fratassina, aiutando ad identificare nuovi obiettivi ed aprire la via ad un nuovo modo di contrastare la malattia.

Questo è un progetto su più anni che comporterà numerosi passi:

1. Decifrare la natura e la composizione del complesso proteico che porta l'Nrf2 actino-ancorato nei mitocondri. Il tentativo di compiere quest'analisi sarà fatta studiando varie linee cellulari umane (incluse cellule prelevate da tessuto neurale come SK-N-AS) e colture cellulari umane primarie (fibroblasti della pelle). Si noti che conosciamo già qualcuno dei componenti di questo complesso, fatto che ci aiuterà nell'identificazione di altri suoi membri.
   1. Lo studio includerà l'analisi BN page del predetto complesso in condizioni non-denaturanti, utilizzando una serie disponibile di anticorpi che mirano a membri putativi del complesso. Il complesso sarà ottenuto con metodi di demolizione (pull-down) standard partendo dalla disgregazione cellulare usando condizioni moderate.
   2. Se necessario, analisi ottenuta attraverso la spettrometria di massa del complesso putativo sia sfruttando la tandem affinity purification di proteine mirate di interesse (possibilmente migliorando il rapporto segnale-rumore per mezzo della generazione di campioni puliti), sia mediante stable isotopic labelling di proteine per discriminare verosimilmente tra contaminanti e binding-partner genuini usando tecniche quantitative MS. Il recente ingaggio nel nostro gruppo di uno specialista di queste tecniche le renderà prontamente disponibili per il progetto, se necessario, essendo la macchina già disponibile nel nostro ospedale.
   3. Al termine di questa parte ci potrà essere l'esclusione di un sotto-gruppo di fratassina, poiché l'esistenza di un tale sotto-gruppo putativo è stato suggerito esista nel citosol cellulare.
   4. Uno studio parallelo con una serie analoga di analisi sarà effettuato, in un secondo passo, su linee cellulari da pazienti. Abbiamo già stabilito che il fenotipo di queste cellule già indica una perdita di ancoraggio di Nrf2 alla rete actinica [8]
2. Mirare ai vari membri del complesso. In questa parte del progetto vogliamo valutare/verificare il ruolo relativo dei vari componenti del complesso, in particolare il loro ruolo nella sensibilità allo stress ossidativo.
   1. vogliamo fare uso del shRNA per reprimere i vari obiettivi (i componenti del complesso) in una linea cellulare (Flp-In T-Rex HEK-293) che ammette una unica e diretta inserzione in un locus definito la cui espressione può, in aggiunta, essere modulata mediante doxiciclina. Abbiamo precedentemente utilizzato con successo questo approccio per sovraesprimere una proteina allotopica della catena respiratoria [9]. Lo spegnimento dell'espressione del gene mirato verrà verificato mediante PRC quantitativa e/o Western blot.
   2. le cellule ottenute saranno estensivamente descritte nel loro fenotipo, specialmente per il potenziale ostacolo della loro sensibilità allo stress ossidativo. Ciò ci darà l'opportunità di modulare le condizioni della coltura cellulare per determinare se non possiamo modulare le conseguenze, possibilmente includendo la stabilità dei complessi ferro-zolfo, in queste diverse cellule.
3. il collegamento perduto... In questa parte del progetto cercheremo di carattterizzare il collegamento esistente tra la fratassina localizzata nella matrice mitocondriale e il complesso contenente Nrf2 localizzato nel citosol. Diverse ipotesi possono essere tracciate per spiegare la disorganizzazione del complesso associato alla carenza di fratassina.
   1. La prima ipotesi è la sovrapproduzione di specie ossidanti da parte dei mitocondri carenti di fratassina nei fibroblasti dei pazienti. Verificheremo questa ipotesi usando sonde fluorescenti redox-sensibili, sapendo che il flusso di elettroni nella catena respiratoria di queste cellule in coltura carenti di fratassina non è affetta quantitativamente. Un intero insieme di cellule con un deficit negli enzimi della catena respiratoria già note per produrre tali specie ossidanti verrà usata come controllo positivo [10].
   2. La seconda ipotesi richiederà l'esistenza di una proteina ferro-zolfo nel complesso legante Nfr2 che dovrà essere eccezionalmente sensibile (in rapporto ad altre ISP) al decremento del contenuto di fratassina mitocondriale. Una proteina come GRX2 che lega il gruppo ferro-zolfo per dimerizzare sarebbe stata un candidato perfetto, ma abbiamo stabilito in precedenza che essa non è affetta nei fibroblasti carenti di fratassina.
4. Ripristinare la normale risposta all'insulto ossidativo. Abbiamo stabilito in precedenza che intrappolando perossido di idrongeno (uno dei composti ossidanti rilasciati dai mitocondri) si ripristina la normale funzione di Nrf2 nei fibroblasti dei pazienti. Tuttavia, intrappolando perossido di idrogeno si può avere una serie di conseguenze non necessariamente ristrette-a o mediate-da un effetto sul complesso legante Nrf2, vogliamo:
   1. analizzare/dimostrare la conseguenza di intrappolamento di perossido sulla stabilità del complesso.
   2. identificare nuovi composti capaci di riallocare Nrf2 in cellule carenti di fratassina. Per questa parte dello studio utilizzeremo fibroblasti derivati da pazienti (immortalizzati in una linea cellulare a rapida crescita), usando la morte cellulare programmata da segnali ossidativi (tracciando la localizzazione di Nrf2 ripristinato) come criterio, e utilizzando la banca di composti (80 000) che abbiamo già testato in precedenti programmi di ricerca in cui siamo stati coinvolti.

Esiti finali che potremmo (vorremmo!) includere:

• una migliore comprensione dell'ostacolata risposta delle cellule carenti di fratassina allo stress ossidativo;
• caratterizzazione di un complesso proteico (e associata via di segnali intracellulari) che può giocare un considerevole ruolo tanto nell'atassia di Friedreich quanto in altre malattie neurodegenerative;
• identificazione di nuovo obiettivo(i) e nuovo composto(i) da sperimentare per contrastare l'atassia di Friedreich.